In vitro verification of the action of the antiplatelet agents ticagrelor, clopidogrel bisulfate and prasugrel hydrochloride as an antibacterial agent against Staphylococcus aureus

Ana Carolina Amaral Coutinho¹
Luiz Francisley de Paiva²
Emerentina Maria Machado Fonseca³
Matheus Henrique Fernandes³
Sérgio Rodrigo Beraldo⁴

 

¹  Acadêmico. Farmácia. Universidade do Vale do Sapucaí – Univás. Pouso Alegre – MG, Brasil.

²  Mestre. Professor. Biólogo especialista em Análises Clínicas. Universidade do Vale do Sapucaí – Univás. Pouso Alegre – MG, Brasil.

³  Acadêmico. Medicina. Universidade do Vale do Sapucaí – Univás. Pouso Alegre – MG, Brasil.

⁴  Doutorando. Professor. Médico especialista em Cardiologia. Universidade do Vale do Sapucaí – Univás. Pouso Alegre – MG, Brasil.

 

Recebido em 26/06/2021

Aprovado em 02/03/2022

DOI: 10.21877/2448-3877.202202160

 

INTRODUÇÃO

 

Staphylococcus aureus é a uma bactéria comum que acomete seres humanos. Sua versatilidade aliada ao seu potencial patogênico faz com que esta espécie se torne uma das principais bactérias responsáveis por infecções sistêmicas nos seres humanos.^(1,2)

O potencial patogênico da Staphylococcus aureus é determinado por um conjunto de componentes e produtos próprios de seu metabolismo que, atuando sozinhos ou em conjunto, são capazes de promover uma infecção no indivíduo. Dessa forma, as características da infecção desenvolvida pelo microrganismo dependerá da interação dos componentes do patógeno com os mecanismos de defesa do hospedeiro.^(3-5)

O perfil oportunista desse patógeno permite o desenvolvimento de infecções em vários locais do organismo, apresentando distintas manifestações clínicas. As manifestações clínicas podem ser apresentadas por indivíduos saudáveis e imunologicamente competentes convivendo em sociedade, mas principalmente por aqueles que se encontram em ambientes hospitalares.⁽⁶⁾ Uma das complicações mais consideráveis decorrentes da colonização do S. aureus é a endocardite infecciosa, que apresenta como manifestações clínicas vegetações valvulares, abscessos, mioperiocardite, dentre outras.⁽⁷⁾

A endocardite infecciosa consiste em uma doença que atinge o tecido cardíaco, especificamente a superfície endocardial do coração, envolvendo principalmente as válvulas cardíacas, seja nativa ou protética.⁽⁷⁾ Segundo Fowler e colaboradores⁽⁸⁾, S. aureus é a principal causa das endocardites infecciosas no mundo, correspondendo a aproximadamente 31% dos casos já relatados.

O endotélio cardíaco é altamente resistente às infecções.⁽⁹⁾ Havendo bacteremia, entretanto, a célula endotelial torna-se alvo de lesões, o que contribui para a evolução da doença. A presença de rupturas ou lesões nas células endoteliais do tecido cardíaco, incluindo válvulas cardíacas, favorece a adesão de microrganismos circulantes a essas superfícies danificadas. As plaquetas são as células responsáveis por promover a ligação do patógeno às células endoteliais danificadas, uma vez que estas proveem ao microrganismo a superfície adesiva necessária.⁽¹⁰⁾

A efetividade do S. aureus encontra-se intimamente ligada a sua capacidade em promover agregação plaquetária, desempenhando um importante papel na patogênese da endocardite infecciosa, uma vez que é capaz de interagir fortemente com os componentes do hospedeiro, aderindo ao endotélio cardiovascular danificado, plaquetas e proteínas plasmáticas, como fibrinogênio e fibronectina.⁽¹⁰⁾

Os principais métodos empregados no tratamento da endocardite infecciosa incluem antibióticos e procedimentos cirúrgicos. Entretanto, distúrbios embolíticos associados à endocardite infecciosa ainda apresentam alto índice de mortalidade. Estudos in vitro recentes, associados a estudos experimentais e estudos clínicos, comprovam a eficácia do uso de antiagregantes plaquetários no tratamento dos eventos decorrentes da endocardite infecciosa, sendo seu uso proposto também como uma possível prevenção para a doença.⁽¹¹⁾

Trombos podem ser definidos como coágulos formados a partir de uma lesão vascular, ou ainda a partir da ativação do processo de coagulação e de distúrbios da corrente sanguínea. Especificamente no cenário de uma endocardite infecciosa, as vegetações formadas ou “trombos” são decorrentes da interação entre as plaquetas e os microrganismos circulantes na corrente sanguínea.⁽¹²⁾

Antiagregantes plaquetários são agentes capazes de inibir a formação de trombos que são induzidos pelo acúmulo de plaquetas. Dessa forma, eles atuam inibindo a formação desses coágulos por meio de mecanismos de inibição das funções plaquetárias, como adesividade e agregação, e liberação ou secreção de substâncias, através de diferentes vias.⁽¹³⁾ Ticagrelor, Bissulfato de Clopidogrel e Cloridrato de Prasugrel são princípios ativos comumente empregados para a prevenção de eventos cardiovasculares caracterizados por trombose, e atuam inibindo os receptores de adenosina difosfato (ADP) presentes na superfície das plaquetas.⁽¹⁴⁾ Estudos recentes indicam que o agente anticoagulante plaquetário Ticagrelor em dosagens convencionais como antiplaquetário pode exercer atividade antimicrobiana, adicionalmente, a sua principal função preventiva, assim como também já foi associado à melhora da função pulmonar em pacientes hospitalizados por pneumonia.⁽¹⁵⁾

Contudo, este estudo tem como objetivo verificar in vitro a atividade antibacteriana de Ticagrelor e outros antiagregantes plaquetários, como Bissulfato de Clopidogrel e Cloridrato de Prasugrel contra cepas padrão de Staphylococcus aureus.

 

MATERIAL E MÉTODOS

 

Microrganismos utilizados e padronização dos inóculos

Foram utilizadas cepas referências de Staphylococcus aureus ATCC 6538 e S. aureus ATCC 25923. As cepas foram reativadas em Ágar Mueller-Hinton, incubados a 37ºC durante 24 horas. Em seguida um pequeno fragmento das colônias foi colocado em uma solução salina de 0,85%. A suspensão resultante foi homogeneizada em agitador tipo Vórtex durante um minuto. A turbidez foi ajustada ao tubo 0,5 da escala de McFarland com auxílio de um espectrofotômetro (CELM E-225 D) com absorbância de 625nm. Este procedimento foi realizado de forma a fornecer uma suspensão padrão de bactérias contendo 1×10⁸ a 2×10⁸ UFC/mL.^(16,17)

 

Preparo da solução farmacológica

Para este estudo, foram utilizados três antiagregantes plaquetários de diferentes marcas provenientes de indústrias farmacêuticas distintas com princípios ativos diferentes e de concentrações não equivalentes, sendo eles: Ticagrelor 90mg, Bissulfato de Clopidogrel 75mg e Cloridrato de prasugrel 10mg.

Inicialmente, os comprimidos de cada fármaco foram delicadamente esmagados ainda em suas embalagens individuais com o auxílio de grau e pistilo de forma que não houvesse rompimento da embalagem. Em seguida, o conteúdo de cada comprimido foi assepticamente transferido para tubos de ensaio com tampa contendo 1mL de água destilada estéril. Os tubos foram agitados em agitador tipo Vórtex até que o material fosse totalmente dissolvido. A esta solução foi dado o nome de solução estoque.

 

Avaliação da atividade antibacteriana por disco-difusão

A verificação da atividade antibacteriana dos fármacos foi realizada pela técnica de disco-difusão de acordo com a metodologia de Kirby-Bauer seguindo o documento M02⁽¹⁷⁾ com modificações. O meio de cultura utilizado foi o Ágar Mueller-Hinton (HIMEDIA). Cada placa de Petri de 90mm de diâmetro continha 25mL do meio de cultura, deixando-as com uma profundidade padronizada de 4mm igualmente em todas as placas.

Com auxílio de um swab estéril embebido na suspensão bacteriana padronizada, o inóculo foi espalhado sobre toda a superfície do meio. As placas ficaram 5 minutos entreabertas dentro de um fluxo laminar para a secagem e, após esse período, foi colocado no centro de cada placa um disco de papel de filtro Whatman nº 1 estéril de 6mm de diâmetro. Em seguida, foi dispensado sobre cada disco um volume de 50µL da solução estoque (que corresponde a 4,5mg para Ticagrelor; 3,75mg para Bissulfato de Clopidogrel; 0,5 mg de Cloridrato de Prasugrel). As placas foram incubadas a 37ºC por 24 horas e após esse período foi verificado se houve a formação do halo de inibição.

 

Determinação da concentração inibitória mínima – CIM

A concentração inibitória mínima dos fármacos foi determinada pela técnica de macrodiluição em tubos de acordo com a norma M07-A10⁽¹⁶⁾ com modificações. Inicialmente, a solução estoque dos fármacos foi diluída 1:1 (v/v) em água destilada estéril em 10 concentrações diferentes, de acordo com a Tabela 1. Em seguida, a suspensão padrão de S. aureus foi diluída em 1:100 em Caldo Mueller-Hinton (HIMEDIA) 2x concentrado. A CIM foi realizada transferindo 1mL da suspensão bacteriana diluída para os tubos contendo os fármacos. O volume final de cada tubo foi de 2mL, resultando em uma concentração final do inóculo de 5×10⁵ UFC/mL de S. aureus. Para o controle negativo de crescimento, foi utilizado um tubo com as mesmas concentrações dos fármacos do tubo 1 (mais concentrado), porém sem o inóculo, e para o controle positivo de crescimento, foi utilizado um tubo com apenas 2mL do meio sem os fármacos, porém com o inóculo.

Os tubos foram incubados a 35ºC por 24 horas. Após esse período, foram adicionados 200µL de Cloreto de Trifenil Tetrazólio (TTC) a 2% a cada tubo, corante que promove a coloração das colônias sem comprometer sua viabilidade, e os tubos foram reincubados por mais duas horas. Após esse período, os tubos que apresentam atividade antimicrobiana permanecem incolores, enquanto os tubos em que houve crescimento microbiano coram-se em vermelho. A CIM foi determinada como a menor concentração dos fármacos que não demonstra crescimento microbiano.

 

Determinação da concentração bactericida mínima – CBM

Antes da adição do indicador TTC, 10µL de cada tubo foram inoculados em meio Ágar Mueller-Hinton (HIMEDIA) e incubados a 35ºC durante 24-48 horas. A concentração bactericida mínima é a concentração de um antimicrobiano que leva à morte de um microrganismo e será definida como a concentração do fármaco mais baixo capaz de matar a totalidade das unidades bacterianas.

 

RESULTADO

 

Neste estudo, as cepas de S. aureus testadas não demonstraram sensibilidade aos antiagregantes testados pelo método de disco-difusão evidenciado pela ausência de halos de inibição, entretanto as cepas foram suscetíveis ao Bissulfato de Clopidogrel pelo método de microdiluição em caldo, como demonstrado na Tabela 2.

 

 

Tabela 1 – Esquema de preparação de séries de diluições dos fármacos para uso em testes de sensibilidade por diluição em caldo.

Tubo	Ticagrelor	Bissulfato de Clopidogrel	Cloridrato de Prasugrel
1	90mg/mL	75mg/mL	10mg/mL
2	45mg/mL	37,5mg/mL	5mg/mL
3	22,5mg/mL	18,75mg/mL	2,5mg/mL
4	11,25mg/mL	9,37mg/mL	1,25mg/mL
5	5,62mg/mL	4,68mg/mL	0,62mg/mL
6	2,81mg/mL	2,34mg/mL	0,31mg/mL
7	1,40mg/mL	1,17mg/mL	0,15mg/mL
8	0,70mg/mL	0,58mg/mL	0,07mg/mL
9	0,35mg/mL	0,29mg/mL	0,03mg/mL
10	0,17mg/mL	0,14mg/mL	0,01mg/mL

 

Tabela 2 – Perfil de suscetibilidade de S. aureus frente aos antiagregantes plaquetários: Ticagrelor, Bissulfato de Clopidogrel e Cloridrato de Prasugrel.

Cepa	Ticagrelor	Bissulfato de Clopidogrel	Cloridrato de Prasugrel
		Concentração inibitória mínima
ATCC 6538	–	9,37mg/mL	–
ATCC 25923	–	9,37mg/mL	–
		Concentração bactericida mínima
ATCC 6538	–	9,37mg/mL	–
ATCC 25923	–	9,37mg/mL	–

 

DISCUSSÃO

 

Pelo método de disco-difusão não foram constatados halos de inibição de nenhum fármaco testado, mas foi observado em todas as placas o crescimento uniforme de S. aureus. Entretanto, pelo método de macrodiluição em caldo, observam-se resultados positivos para o Bissulfato de Clopidogrel. Tal resultado não surpreendeu, uma vez que o método de disco-difusão foi realizado com uma concentração de 3,75mg para o Bissulfato de Clopidogrel sendo 2,5 vezes menor que a CIM encontrada pelo método de macrodiluição.

Diversos métodos laboratoriais podem ser empregados para predizer a suscetibilidade in vitro de bactérias aos agentes antimicrobianos. Muitos laboratórios de microbiologia clínica usam, de forma rotineira, o método de disco-difusão em ágar para testar patógenos comuns de crescimento rápido e certas bactérias fastidiosas.⁽¹⁷⁾ Contudo, existem outros métodos que fornecem resultados essencialmente equivalentes ou até mais precisos, como a microdiluição em caldo, entretanto demandam um tempo maior para liberação de resultados.

O teste de disco-difusão é um método reprodutivo, padronizado, de execução simples e baixo custo. Os diâmetros dos halos de inibição, quando presentes, são mensurados em milímetros e os resultados são interpretados comparando-os com os valores de referência publicados anualmente no Clinical Laboratory Standard Institute (CLSI). Este método fornece um resultado qualitativo que na maioria das situações clínicas é suficiente para orientar a escolha terapêutica. Entretanto, quando utilizamos o método de disco-difusão para pesquisa de novos agentes antimicrobianos, naturais ou sintéticos, que ainda não têm parâmetros que o classifique em sensível, intermediários ou resistentes, resultados baseados apenas na presença ou ausência de um halo de inibição, sem consideração do tamanho do halo, podem ser úteis como uma espécie de triagem em que a presença do halo de inibição indica atividade antimicrobiana. Já a ausência do halo não necessariamente pode ser um resultado negativo, sendo necessária a realização de novos testes por outros métodos para a confirmação. Os métodos de diluição em caldo são mais elaborados, demandam tempo e cuidados para a realização, entretanto são aceitáveis para medir quantitativamente a atividade in vitro de um agente antimicrobiano contra um determinado isolado bacteriano.

Com relação à atividade antimicrobiana dos agentes antiplaquetários, Li et al.,⁽¹⁸⁾ e Lancelloti et al.,⁽¹⁵⁾ relatam efeito antimicrobiano de Ticagrelor em cepas bacterianas Gram-positivas, entretanto neste estudo não foi demonstrado tal atividade. Vale ressaltar que neste estudo o medicamento foi avaliado in vitro na sua forma de comprimido, diferente do estudo de Lancelloti et al.,⁽¹⁵⁾ que utilizou o princípio ativo do fármaco e experimento com modelo animal.

Neste estudo foi verificado o efeito antimicrobiano de Clopidogrel e tal resultado condiz com os estudos de Swoboda et al.,⁽¹⁹⁾ em que os agentes antiplaquetário Tienopiridina, Ticlopidina e seu análogo, Clopidogrel, mostraram potencialização da ação de antibióticos beta-lactâmicos, revertendo o fenótipo de resistência à meticilina do Staphylococcus aureus resistente à meticilina (MRSA), in vitro. Esse efeito antimicrobiano observado para o Clopidogrel durante os experimentos pode estar associado a fatores de virulência do patógeno, os quais são determinantes na patogenicidade do microrganismo. Sabe-se que os fatores de virulência encontrados na maioria das espécies bacterianas não são fatores essenciais a sua sobrevivência no interior das células hospedeiras, entretanto são necessários para a promoção de uma infecção efetiva. Segundo Swoboda et al.,⁽¹⁹⁾ em se tratando da espécie Staphylococcus aureus, o ácido teicoico da parede (WTA) é uma das moléculas responsáveis pela patogenicidade exercida, estando esta localizada na parede celular bacteriana. A ausência de WTA dificulta a colonização do patógeno nos tecidos hospedeiros, além de apresentar uma diminuição significativa na capacidade de promover infecção em modelos animais. WTA são polissacarídeos aniônicos da superfície celular de bactérias Gram-positivas necessários para a colonização do hospedeiro e já foram sugeridos como alvos para novos antimicrobianos. Ao contrário do peptideoglicano, os polímeros de WTA não são essenciais para a viabilidade, no entanto os genes em muitas das vias biossintética são condicionalmente essenciais.⁽¹⁹⁾

A Ticlopidina e seu análogo Clopidogrel são pró-drogas Tienopiridinas que inibem a agregação plaquetária mediada pela adenosina-5’-difosfato (ADP). De acordo com Farha et al.,⁽²⁰⁾ essas Tienopiridinas também inibem a ação do TarO, a primeira enzima na síntese do WTA. Nos estudos de Swoboda et al.,⁽¹⁹⁾, a Ticlopidina foi antagônica aos bloqueios genéticos da síntese de WTA de ação tardia e, de forma semelhante, antagonizou a inibição pelo Targocil, um inibidor da enzima de ação tardia TarG. In vitro, a Ticlopidina também inibiu a função do TarO recombinante. Os autores ainda demonstram que evitar a conclusão da biossíntese de WTA, uma vez que tenha sido iniciada, desencadeia a parada do crescimento microbiano.

Bissulfato de Clopidogrel é um fármaco pertencente à classe de medicamentos dos antiagregantes plaquetários que apresenta mecanismo de ação semelhante ao da Ticlopidina.⁽¹⁴⁾ Estudos realizados por Nicolau et al.⁽²¹⁾ demonstraram, em modelos animais, o potencial desta classe de medicamentos no tratamento da endocardite infecciosa, como uma terapia antiplaquetária adjuvante. Os experimentos obtiveram resultados positivos quando utilizados como terapia única e resultados ainda melhores quando combinados a outras terapias antimicrobianas, proporcionando uma redução no tamanho de vegetações presentes nas válvulas aórticas e, com isso, uma maior exposição bacteriana aos antibióticos administrados em paralelo. Em contrapartida, Li et al.⁽¹⁸⁾ acreditam que o uso de inibidores orais P2Y12 é uma das causas responsáveis pelo aumento no risco de infecções bacterianas em pacientes que fazem uso desses medicamentos. Ticagrelor e Clopidogrel são fármacos pertencentes a essa classe de inibidores plaquetários, sendo empregados com o intuito de prevenir eventos cardiovasculares decorrentes da agregação plaquetária. Para Lancelloti et al.,⁽¹⁵⁾ o risco de infecção estaria associado aos seus mecanismos farmacodinâmicos, que envolvem a redução na liberação de plaquetas pró-inflamatórias nos grânulos alfa e a formação de agregados pró-inflamatórios de leucócitos plaquetários. Entretanto, Ticagrelor, mas não o Clopidogrel, foi sugerido por ter efeitos protetores contra infecções. O ensaio de Inibição de Plaquetas e Resultados do Paciente (PLATO) mostrou que os pacientes tratados com Ticagrelor tinham menor risco de pneumonia, morte por pneumonia e sepse do que o Clopidogrel.^(22,23)

 

CONCLUSÃO

 

Foi verificada in vitro uma ação antibacteriana frente ao Staphylococcus aureus utilizando o comprimido do antiagregante plaquetário Bissulfato de Clopidogrel. O resultado deste estudo não encoraja a prescrição de Clopidogrel como antimicrobiano em casos de bacteremia por S. aureus, mas sem a continuação do estudo por outros métodos analíticos e de associações farmacológicas.

 

 

REFERÊNCIAS

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Correspondência

Prof. Luiz Francisley de Paiva

Laboratório de Pesquisa Unidade Central

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