Research of crioaglutinins in old patients of the city of Patos, Paraíba

 

Maria Isabela Ferreira de Araujo¹

Maria Aparecida Mariz de Lima²

Marcos Mateus Leandro de Assis³

Maria Margareth Câmara de Almeida⁴

 

¹Mestranda. Universidade Federal da Paraíba (UFPB) – João Pessoa, Brasil.
²Bacharel em Biomedicina. Faculdades Integradas de Patos (FIP) – Patos – PB, Brasil.
³Graduando em Biomedicina. Faculdades Integradas de Patos (FIP) – Patos – PB, Brasil.
⁴Mestre. Professora – Faculdades Integradas de Patos (FIP) – Patos – PB, Brasil.

Instituição: Faculdades Integradas de Patos (FIP) – Patos – PB, Brasil.

Recebido em 04/04/2018

Artigo aprovado em 06/11/2018

DOI: 10.21877/2448-3877.201800692

 

INTRODUÇÃO

A defesa do organismo é ativada mediante a presença de agentes infecciosos, contudo, em algumas situações ocorre uma falha nesse sistema, desencadeando uma resposta imunológica anormal.⁽¹⁾ Segundo Ressurreição et al.,⁽²⁾ o surgimento das doenças autoimunes (DAI) é devido a uma perda persistente dos mecanismos de controle responsáveis por manter a tolerância aos antígenos próprios. Esses mecanismos autoimunológicos são multifatoriais e suas ativações podem estar relacionadas com alterações genéticas, físicas e químicas dentre outras.⁽³⁾

Determinados tipos de autoanticorpos possuem atração por antígenos localizados em células sanguíneas como as hemácias, e essa relação promove efeitos fisiológicos deletérios, como a constante lise dos eritrócitos e conse­quentemente o surgimento de complicações hematológicas graves. Fatores ambientais externos favorecem o aparecimento do quadro clínico, como, por exemplo, alterações na temperatura corporal.⁽⁴⁾

Patogenicidade desenvolvida é relatada como anemia hemolítica autoimune (AHAI) e está relacionada com anticorpos diversos, cada qual atuando em situações térmicas distintas. Nesse contexto destacam-se os anticorpos frios da classe IgM, que influenciam na aglutinação e hemólise de hemácias expostas às baixas temperaturas, classificando-os como crioaglutininas.⁽⁵⁾

Segundo Kottayam et al.,⁽⁶⁾ a AHAI acomete todos os grupos raciais e todas as faixas etárias, no entanto, pacientes com idade superior a 48 anos são mais susceptíveis ao aparecimento da patologia.

A ação das crioaglutininas pode ser mediada por processos infecciosos, uso de medicamentos e vinculadas a processos anêmicos.⁽⁷⁾ Infecções por Mycoplasma pneumo­niae facilitam o desenvolvimento da anormalidade, uma vez que, durante o quadro clínico, o organismo eleva a produção de anticorpos que conseguem reconhecer antígenos celulares próprios.⁽⁸⁾

O diagnóstico é realizado por meio da técnica de Coombs, na qual são observados anticorpos IgM ligados aos antígenos eritrocitários.⁽⁹⁾ O soro de Coombs permite a identificação específica, no entanto, testes mais específicos são realizados, como a citometria de fluxo, a fim de se obter maior precisão e confiabilidade no diagnóstico laboratorial.^(10,11)

Em associação a esses procedimentos faz-se uso do método manual direto de brometo de hexodimetria (Polybrene), que demonstra resultados satisfatórios quando realizado em baixas temperaturas.⁽¹²⁾

Dessa forma, esse trabalho objetivou avaliar a presença de crioaglutininas em amostras sanguíneas de pacientes atendidos em um laboratório de análises clínicas na cidade de Patos-PB, sendo esses indivíduos com idade superior a 60 anos, sem diagnóstico prévio para AHAI.

MATERIAL E MÉTODOS

Trata-se este estudo de uma pesquisa experimental qualitativa com análise de anticorpos frios (crioaglutininas) em pacientes idosos atendidos em um laboratório de análises clínicas, localizado na cidade de Patos, estado da Paraíba. A população foi formada por vinte idosos com idade superior a 60 anos, atendidos no referido laboratório.

A amostragem foi constituída pelos voluntários que se dispuseram a participar da pesquisa. Foram incluídos no estudo idosos com características clínicas de acrocianose e sem sintomas prévios para AHAI, e excluídos aqueles que apresentaram outras patologias que corroborassem para resultados falsos positivos, tais como mononucleose infecciosa.

Os pacientes foram submetidos a uma triagem por meio de questionário contendo seis perguntas relacionadas com a sintomatologia da AHAI, e os resultados adquiridos foram analisados estatisticamente pelo teste qui-quadrado, com níveis de significância de p = 0,05. O software utilizado para essa análise estatística foi o Statistical Package for the Social Sciences (SPSS) 20.0 para Windows.

Após coletadas, as amostras foram levadas ao Laboratório Escola Biolab, na cidade de Patos-PB para as devidas análises. Foram devidamente registradas e submetidas ao teste de aglutinação para pesquisa de crioagluti­ninas. A técnica seguiu a metodologia proposta por Rodri­gues et al.,⁽¹³⁾  utilizando-se para o teste dez tubos de ensaios, onde, a partir do segundo tubo, foram adicionados 200 µL de solução fisiológica para realizar diluição seriada e posteriormente titulação dos resultados. No primeiro tubo foram colocados 200 µL de hemácias tipo “O” e 200 µL do soro do paciente a ser pesquisado; no segundo tubo, além dos 200 µL de solução fisiológica foram acrescentados 200 µL de hemácias “O” e 200 µL do soro do paciente. Foram retirados 200 µL do homo­geneizado do 2° tubo e colocado no 3° tubo e esse procedimento segue até o último, com diluições que variaram de 2 µL/mL até 1.024 µL/mL. Os tubos foram levados à geladeira para conservação em temperatura de aproximadamente 4ºC durante 24 horas.

A interpretação dos resultados seguiu os padrões propostos por Alves et al.,(¹⁴⁾  que afirmam que a positividade para a presença de crioaglutininas é visualizada nos tubos que apresentaram coágulos resistentes mesmo após retirados das condições condi­cionantes e submetidos a agitação constante, demonstrando, portanto, que a presença de autoanticorpos é suficiente para prolongar a aglutinação das hemácias.

Ética

Este projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa das Faculdades Integradas de Patos (FIP) (1.915.977). Todos os participantes selecionados assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido (TCLE).

Resultados

Os resultados do teste laboratorial para pesquisa de crioaglutininas obtidos pela técnica manual e os dados estatísticos provenientes de questionários aplicados aos indivíduos submetidos foram adequadamente tabelados. O estudo contou com vinte participantes, sendo 75% mulheres (Tabela 1), todos com idade superior a 60 anos. Foi perguntado aos participantes sobre a manifestação de frio, mesmo quando expostos a temperaturas elevadas, 95% negaram o incômodo. Já para a sensação de frio em baixas temperaturas, 25% admitiram sentir frio em excesso (Tabela 2). Em relação à presença de extremidades cianó­ticas a tais temperaturas, 20% dos entrevistados afirmaram visualizar essa anormalidade. Similaridade observada quanto à clínica de processos anêmicos em tais pacientes, onde apenas 20% apresentavam histórico de anemia (Tabela 3).

Em suma, 25% dos entrevistados relataram dificuldade para respirar (Tabela 4), contudo 100% da amostra não obteve  reatividade para o teste laboratorial efetuado (Tabela 5).

 

Discussão

A AHAI é mediada por autoanticorpos IgM, que agem contra antígenos na forma de polissacarídeos localizados na superfície das hemácias; devido à indução desse evento, essas moléculas imunológicas são denominadas crio­aglutininas ou anticorpos “frios”.⁽¹⁵⁾ Fatores como mudanças na temperatura que variam de 4°C a 18°C, respostas a doenças infecciosas ou doenças linfoproliferativas podem influenciar no aparecimento dessa alteração imune.⁽¹⁶⁾

As infecções decorrentes de pneumonia por germe atípico como Mycoplasma pneumoniae (M. pneumoniae) induzem o organismo a produzir anticorpos direcionados à destruição do patógeno, contudo esses podem se direcionar para os eritrócitos e causar aglutinação dos mesmos.^(17,18) Entretanto, durante a entrevista realizada com os pacientes submetidos à pesquisa não houve relatos de infecções causadas por M. pneumoniae, auxiliando desse modo na veracidade dos resultados encontrados.

Assim como a AHAI, infecções por M. pneumoniae provocam problemas respiratórios decorrentes de defeitos no trato respiratório superior, afetando principalmente crianças e idosos.^(19,20) Em contrapartida, 75% dos indivíduos relataram não possuir este desconforto proveniente das pato­genias, auxiliando dessa forma nas análises clinicas e laboratoriais.

No entanto, critérios são usados para eliminar possíveis suspeitas relacionadas à relação entre essas duas patologias, um deles está intimamente ligado ao fato que a sintomatologia desencadeada por crioaglutininas se manifesta após uma ou duas semanas da infecção por M. pneumoniae,⁽²¹⁾ no entanto os indivíduos avaliados apresentaram clínica estável, sem complicações que pudessem remeter a sintomas inerentes à presença de autoanticorpos frios.

Segundo Shi et al.,⁽²²⁾ a forma idiopática ou primária é a principal causa para o aparecimento dessa característica imunológica, afetando particularmente indivíduos na sexta ou sétima década de vida,⁽²³) razão essa que gerou o suporte para o andamento deste trabalho, visto que os pacientes apresentavam idade igual ou superior a 60 anos.

Temperaturas inferiores a 36°C são capazes de provocar mudanças fisiológicas no organismo, e as situações variam desde tremores, caso ocorra uma mudança para aproximadamente 35°C, até coma e parada respiratória caso esses valores fiquem em torno de 27º e 20°C respectivamente.⁽²⁴⁾ No entanto, os pacientes não relataram sintomas inerentes ao frio que remetesse a quadros graves, 5% dos indivíduos declararam sentir desconfortos térmicos mesmo estando em temperaturas elevadas, contudo essa manifestação pode estar relacionada a fatores não associados a AHAI.⁽²⁵⁾

A sintomatologia é desencadeada devido à agluti­nação eritrocitária ou pela presença do processo anêmico favorecido pela hemólise, induzindo, portanto, estágios distintos da patogenia, como a anemia hemolítica crônica e aguda, sendo essa última responsável por estabelecer hemo­globinúria, acrocianose nas extremidades corpóreas dentre outras.(26) Apenas 20% dos entrevistados informaram apresentar essa característica, que pode estar relacionada com insuficiência cardíaca, choque, doenças da circulação sanguínea e o frio em excesso, razão esta fundamental para haver uma investigação mais precisa sobre as causas que estão contribuindo para esse evento.^(27,28)

Segundo Poma,⁽²⁹⁾ a AHAI pode estar associada com o lúpus eritematoso sistêmico entre 5%-10 % nos indivíduos, razão pela qual ocorre a dificuldade na terapêutica, pois as sintomatologias clinicas podem estar mascaradas; essa analogia foi eliminada durante essa pesquisa, uma vez que um paciente com lúpus apresentou resultado não reagente para a presença de crioaglutininas.

Na anemia hemolítica primária, a hemólise é o único achado laboratorial e não está correlacionada com outra patologia que explique esse processo clínico, mostrando, portanto, que a efetividade do teste sobrepõe a presença de outras disfunções não relatadas pelos pacientes.

Devido às características apresentadas dessa pato­genia torna-se necessário o uso de testes laboratoriais apropriados, que contenham maior especificidade.⁽³¹⁾ O teste de Coombs e a citometria de fluxo são os preferíveis nas análises, devido às suas aplicabilidades e precisão, entretanto, técnicas laboratoriais mais acessíveis estão sendo exploradas a fim de se obter maior confiabilidade e precisão.^(32,33)

O Polybrene surge como uma nova alternativa na busca por acessibilidade e exatidão laboratorial, estudos confirmam que o mesmo possui maior sensibilidade, rapidez e baixo custo quando comparado com testes convencionais,⁽³⁴⁾ razão pela qual foi utilizado nesta pesquisa, uma vez que o diagnóstico laboratorial muitas vezes é inacessível para alguns indivíduos.

Esse método emite os resultados por meio de titulação e reflete a amplitude em que os autoanticorpos encontram-se ligados à membrana das hemácias quando submetidos a baixas temperaturas,⁽³⁵⁾ constatando assim que o estabelecimento de condições apropriadas e a precisão nas análises são suficientes para se adquirirem resultados seguros, como visto na estratégia usada nesse estudo.

 

Conclusão

 

Diante desses resultados, torna-se evidente que a presença de AHAI em idosos ainda é considerada uma patogenia rara e pode ser desencadeada por fatores externos como a infecção por Mp, no entanto, a exposição a temperaturas baixas é considerada o principal fator de risco para o aparecimento da sintomatologia. Embora as amostras verificadas nessa pesquisa apresentem-se como não reagentes para autoanticorpos IgM, é de extrema importância a realização de testes mais específicos a fim de se detectarem as possíveis causas que estejam proporcionando tais sintomas.

 

Agradecimentos

Os autores agradecem às Faculdades Integradas de Patos pelo apoio estrutural e financeiro para a imple­men­tação deste trabalho.

 

 

Abstract

Objective:  To detect the presence of cryoagglutinins in blood samples of patients over 60 years old, without previous diagnosis of Autoimmune Hemolytic Anemia (AHAI). Methods: The collected venous blood samples were submitted to a microdilution technique, 10 test tubes were used, in which the first one contained 200 mL of O-type red erythrocytes and 200 mL of the serum of the patient to be investigated, from the 200 mL of “O” red blood cells, 200 mL of the patient’s serum and 200 mL of physiological solution were present in the second tube, necessary for serial dilution, by withdrawing 200 mL of the homogenate into the posterior tube in order to obtain a dilution of up to 1024 mL / mL. Results: Twenty patients older than 60 years of age did not present reactivity to the laboratory test, however, 25% reported feeling excessive cold when exposed to low temperatures, and 20% presented cyanotic extremities in these situations. Conclusion: AHAI in the elderly is therefore considered to be a rare pathogenesis, however, clinical signs appear as a diagnostic alert, requiring more sensitive and specific tests in order to accurately assess autoantibody which have affinity for erythrocytes.

 

Keywords

Anemia; Antibody; Erythrocytes

 

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Correspondência

Maria Isabela Ferreira de Araujo

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