Effect of chitosan consumption in lipidic parameters, glycemics and intestinal microflora in rats Wistar

 

Camila Girotto1

Francielle Garghetti Battiston2

Luiza Vivan1

Mateus Fracasso1

 

 

1Graduando em Ciências Biológicas pela Universidade do Oeste de Santa Catarina (UNOESC) – Campus de Xanxerê, SC, Brasil.

2Mestre em Ciências Fisiológicas – UFSC; Professora da Universidade do Oeste de Santa Catarina -(UNOESC) – Campus de Xanxerê, SC, Brasil.

 

Instituição: Universidade do Oeste de Santa Catarina (UNOESC) – Campus de Xanxerê, SC, Brasil.

 

Artigo recebido em 12/12/2016

Artigo aprovado em 30/01/2017

DOI: 10.21877/2448-3877.201700553

 

 

Resumo

A obesidade tornou-se frequente em países em desenvolvimento, acarretando em problemas cardiovasculares e outras doenças metabólicas. Entre as formas de combater a obesidade está a alimentação saudável, principalmente com a inserção de fibras. O objetivo da pesquisa foi verificar se ocorreria redução na massa corpórea de ratos suplementados com quitosana, diminuição dos parâmetros lipídicos e glicêmicos e verificar seu efeito em relação à microbiota intestinal. Foram utilizados 16 ratos machos e 16 fêmeas da linhagem Wistar, os quais foram divididos em quatro grupos (n=4 machos e n=4 fêmeas), C, CQ, H e HQ. O tratamento teve duração de 71 dias. Houve redução na massa corporal dos grupos tratados com quitosana, porém, não significantes estatisticamente; no entanto, a ingestão alimentar nos grupos tratados com quitosana foi maior comparada a seus controles, os níveis de colesterol total, triglicerídeos e glicemia foram diminuídos em ratos suplementados com quitosana. A análise da microbiota intestinal demonstrou que a concentração de Lactobacillus e Bifidobacterium, embora não tenha sido significativa estatisticamente, apresentou um aumento da concentração destas bactérias em ratos suplementados com a fibra. De acordo com os resultados obtidos no estudo, a quitosana age no controle da massa corpórea, especialmente pela ação no metabolismo dos lipídios, atuando também como um prebiótico, auxiliando no aumento da concentração de probióticos, regulando as funções da microbiota intestinal.

 

Palavras-chave

Quitosana; Obesidade; Microbiota intestinal; Parâmetros lipídicos

 

 

INTRODUÇÃO

 

A obesidade tornou-se frequente na população de países em desenvolvimento, independente da classe social, levando a ocorrência de diabetes mellitus tipo 2 e doenças cardiovasculares. Entre as formas de combater a obesidade, a alimentação saudável com inserção de fibras favorece a perda e manutenção da massa corpórea. As fibras são de extrema importância, pois podem atuar no controle da absorção dos carboidratos e da glicemia bem como na diminuição de triglicerídeos e colesterol. Pode também estar relacionada com o aumento da massa bacteriana devido à fermentação das fibras alimentares.(1)

A prevalência de doenças crônico-degenerativas e cardiovasculares tem aumentado nos últimos anos, e um dos principais fatores que desencadeiam estes problemas é devido ao excesso de gordura corporal, causado pelo aumento de açúcares simples e gorduras saturadas e gorduras trans. A diminuição do consumo de fontes vegetais ricas em fibras também é um dos fatores.(2)

Para a prevenção e o tratamento das doenças crônico-degenerativas é necessária a inclusão de atividade física e mudanças na dieta. A quitosana é a forma desacetilada da quitina, que é encontrada como constituinte do exoes­queleto de artrópodes tais como caranguejo, camarão, lagosta e outros insetos.(3) Considerada como um alimento funcional pela Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA), ela auxilia na redução da absorção de gordura e colesterol no corpo humano, sendo a gordura posteriormente eliminada pelas fezes. Promove ainda o aumento do bolo fecal e a frequência da defecação auxiliando como uma medida preventiva contra câncer de cólon.(4)

Diante do exposto, objetivou-se investigar os efeitos da quitosana e a sua importância em relação á diminuição de massa corpórea e dos níveis de colesterol, glicemia, e triglicerídeos. Verificar também possíveis alterações na microbiota intestinal de ratos wistar que realizam a suple­mentação com quitosana, para o equilíbrio do organismo e funcionamento intestinal adequado.

 

MATERIAL E MÉTODOS

 

Protocolo de Análise

Foram utilizados 32 ratos (16 machos e 16 fêmeas) da linhagem Wistar, provenientes do Biotério da Univali, SC. Os animais recebidos tinham 45 dias e foram mantidos em gaiolas com quatro animais cada, em ambiente com temperatura controlada (21 ± 2°C), com ciclo claro/escuro (12/12 h), com livre acesso à comida e água. Todos os protocolos e procedimentos experimentais relativos ao projeto foram aprovados pela Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA) da Unoesc, sob protocolo número 023/2015.

Os animais foram distribuídos em quatro grupos, contendo oito animais cada, mantidos em aclimatação com dieta comercial por duas semanas; posteriormente receberam a administração das dietas definidas de acordo com os grupos, sendo eles: grupo controle (C) – receberam ração comercial (Nuvilab®) e água durante todo o processo experimental; grupo Controle + Quitosana (CQ) – receberam ração comercial (Nuvilab®) com suplementação de quitosana a 5% (m/m) e água; grupo Hipercalórico (H) – receberam ração hipercalórica (feita a partir de alimentos hipercalóricos moídos e oferecidos em forma de péletes) e água e o grupo Hipercalórico + Quitosana (HQ) – ração hipercalórica com quitosana a 5% (m/m) e água.

Após o término do processo experimental, totali­zando 71 dias, os ratos fizeram jejum de 12 horas e foram anes­tesiados com ketamina/xilazina® na quantidade de 90 mg/kg e 10 mg/kg de peso corporal respectivamente, decapitados para a coleta de sangue, para avaliação dos parâmetros metabólicos e dissecados para a retirada dos órgãos.

A ração utilizada para os grupos controle foi a ração comercial para ratos (Nuvilab® CR1). Nos grupos com suplementação de quitosana, foram adicionados 5% (m/m) de quitosana pura em pó à ração, conforme AIN-93G.(5) Para a ração do grupo Controle + quitosana, a ração comercial foi triturada, sendo acrescentada a ração 5% (m/m) de quitosana, juntamente com gelatina incolor (1g) e água para aumentar a coesão entre as partículas. A dieta hipercalórica apresentava a composição: 15 g de ração comercial, 10 g de amendoim torrado, 10 g de chocolate ao leite, 5 g de biscoito maisena e água somente para juntar os ingredientes.

Os animais foram pesados com balança semianalítica digital uma vez por semana para verificar se estava ou não ocorrendo variação de massa corpórea. Também eram pesadas as rações depositadas e sobras, bem como era medida a água depositada e consumida.

A dosagem de glicemia foi realizada nos animais em jejum (12-14 horas) no início do experimento (dia 0), 30 e 69 (48 h antes da eutanásia), por meio do sistema de fitas (monitor digital) glicosímetro G-TECH sistema NO CODE, a partir de gota de sangue obtida através de um corte na extremidade da cauda do animal.

Os animais permaneceram 12 horas em jejum, quando foi realizada a coleta de sangue (tempo 0′) e dosada sua glicemia. Em seguida foi administrada, por via intra­peritoneal, uma solução de glicose a 50% (m/v) na dose de 1,5 g de glicose/kg de massa corporal. A coleta de sangue e as respectivas análises repetiram-se nos minutos trinta, sessenta e cento e vinte. As concentrações de glicose sanguínea foram determinadas com o sistema de fitas (monitor digital) glicosímetro G-TECH sistema NO CODE.

A análise do perfil lipídico foi realizada no último dia de experimento, sendo coletado o sangue dos animais após a eutanásia, por decapitação do animal. Os parâmetros analisados foram: colesterol total, HDL, LDL e triglicerídeos, a partir de kits comerciais (Labtest).

Após a eutanásia, os intestinos dos animais foram retirados e realizada a coleta de 1 g de fezes contidas no intestino grosso de cada animal. Para o preparo dos meios, pesaram-se 70 g de Agar MRS Lactobacillus (Acume­dia) e para preparar 1 litro do meio o agar foi dissolvido em água destilada. Também, utilizou-se o meio BMS Bifidobac­terium (Sigma), pesando-se 55,5 g de agar para 1 litro de meio, com adição de 2,0 g de extrato de levedura por litro, sendo ambos os meios autoclavados a 121ºC por 15 minutos. A adição do extrato de levedura como uma forma de suplemento para o crescimento de bifidobactérias foi proposta a partir de estudo realizado.(6)

As fezes previamente pesadas de cada animal foram dissolvidas em 9 mL de solução salina a 0,85% e a partir desta dissolução (10-1) foram realizadas diluições decimais seriadas até 10-8, por meio da transferência de 1000 µL da diluição anterior para o tubo seguinte. Foram utilizados 100 µL de cada diluição e semeados por método pour plate em placas de petri estéreis vazias, adicionando-se posteriormente aproximadamente 20 mL do meio (específico para cada bactéria) sobre a diluição e homogeneizado com movimentos circulares. As placas foram incubadas a 37ºC durante 48 horas (Lactobacilos) e 72 horas (Bifidobactérias) em estufa com sistema de geração comercial de atmosfera anaeróbica (Anaerobac, Probac ®). Transcorrido o tempo de incubação, foi realizada a contagem de Unidades Formadoras de Colônias (UFC/mL) de cada meio.

Após a eutanásia, os órgãos pesados foram: fígado, rins, baço, intestino, cérebro e as gorduras (omental, perigonadal/epididimal e retroperitoneal/perirrenal).

 

Avaliação Estatística

A avaliação estatística dos dados foi realizada no programa GraphPad Prism 5.01. O teste ANOVA de 1 via (one-way ANOVA) com pós-teste Tukey foi utilizado para a comparação de dados entre os grupos. O nível de significância adotado foi de 95% (p<0,05).

 

RESULTADOS

 

Durante o período experimental, foi acompanhada a massa corporal semanal dos grupos até o final do experimento. Como mostra o Gráfico 01.

 

Gráfico 1. Acompanhamento da massa corporal durante o período experimental. Não houve diferença significativa. (p<0,05, n=32).Fonte: Os autores, 2016.

 

Durante todo o período experimental foi realizado o acompanhamento do consumo alimentar e da ingestão hídrica dos animais, a partir das sobras dos mesmos (Gráfico 2).

 

 

Gráfico 2. Ingestão alimentar semanal e ingestão hídrica. (*) diferença significativa por efeito da quitosana e (#) diferença significativa por efeito da dieta hipercalórica (p<0,05, n=32). Fonte: Os autores, 2016.

 

 

Os resultados das análises dos parâmetros lipídicos e glicêmicos encontram-se na Tabela 01.

 

 

A partir das fezes contidas no intestino grosso dos animais, realizaram-se as análises microbiológicas para avaliar a concentração de Lactobacillus spp. e Bifidobac­terium spp. Ambos os resultados encontram-se representados no Gráfico 03.

 

 

Gráfico 3. Concentração de Lactobacillus spp. e Bifidobacterium spp. Não houve diferença significativa. (p<0,05, n=32).

 

 

Em relação à massa dos órgãos não foram observadas diferenças significativas entre os grupos. Somente em relação às gorduras perigonadal/epididimal e retrope­rito­neal/perirrenal.

 

DISCUSSÃO

 

O presente estudo visou estudar a ocorrência de possíveis alterações metabólicas provenientes da alimentação, buscando analisar a relação de possíveis benefícios da suplementação com quitosana em animais com dieta normocalórica e principalmente avaliar os efeitos em dietas hipercalóricas, analisando a resposta da suplementação perante a dieta.

Diversos estudos tem apontado o efeito da quitosana em reduzir as concentrações de colesterol total, triglice­rídeos, LDL e aumento do HDL. Neste estudo foi possível verificar que os valores de colesterol total e triglicerídeos foram significativamente diminuídos nos grupos com suple­mentação de quitosana (CQ e HQ), e o HDL foi aumentado no grupo CQ; no entanto, a suplementação com quitosana não foi capaz de aumentar a concentração de HDL no grupo HQ. Da mesma forma, o LDL foi diminuído no grupo CQ, mas não obteve o mesmo efeito no grupo HQ, diferente do que foi abordado em estudo(7) que analisou os efeitos da suplementação de quitosana em ratos diabéticos, sendo observada uma redução dos níveis de colesterol total, triglicerídeos, LDL e aumento de HDL. Por sua vez, Anandan R. et. al.(8) avaliaram a resposta de ratos wistar jovens (2-3 meses de idade) e ratos idosos (20-25 meses de idade) quanto à suple­mentação de 2% (m/m) de quitosana e perceberam que ambos obtiveram boa resposta em relação à diminuição dos níveis de colesterol total, LDL e aumento do HDL. Segundo estudo de Anraku M et al.,(9) a suple­mentação de quito­sana também foi capaz de reduzir os níveis de colesterol total, triglicerídeos, LDL e aumentar os níveis de HDL em ratos hipertensos, utilizados como modelo de síndrome metabólica, após quatro semanas.

Para a diminuição dos parâmetros lipídicos, a quito­sana pode atuar como uma resina de troca iônica, ligando-se a ânions hidrofóbicos, como os ácidos biliares no intestino, formando micelas, fazendo com que haja diminuição na sua reabsorção, sendo excretadas nas fezes, o que resulta em uma diminuição na absorção do colesterol e triglicerídeos.(10,11) Confirmando tal teoria, em estudos realizados, verificou-se que ratos Wistar que receberam suple­mentação de quitosana apresentaram uma absorção de colesterol diminuída em relação ao grupo controle, sendo que a excreção de gorduras a partir das fezes foi significativamente maior.(10,12,13)

Em relação à massa corporal dos animais, os mesmos apresentaram médias similares no início do experimento. No entanto, no decorrer do experimento, apresentaram diferenças em relação ao ganho de massa. Os grupos com suplementação de quitosana (CQ e HQ), embora não tenham obtido diferenças significativas, apresentaram um menor ganho de massa corporal em relação aos seus controles. Em sua pesquisa, Geremias R(11) verificou que os ratos suplementados com 5% (m/m) de quitosana apresentaram redução em sua massa corporal quando comparados com o controle e hiperlipídico. Diferente de Cherem & Bramorski(14) que, em sua pesquisa, não observaram diferenças na redução da massa corporal de ratos suple­men­tados com quitosana e os grupos controle. Entretanto, Trautwein E, et al. (15) verificaram que hamsters que consumiram dietas com 8% (m/m) de quitosana tiveram sua massa corporal diminuída significativamente; no entanto, ao utilizar suplementação de 4% (m/m) de quitosana, a diminuição da massa corporal não foi tão efetiva.

Os ratos que receberam suplementação com quito­sana (CQ e HQ) aumentaram o seu consumo alimentar ao serem comparados com seus controles. O mesmo pode ser observado em estudo realizado por Cherem & Bramorski(14) ao adicionar à dieta hipercalórica de ratos Wistar 5% (m/m) de quitosana de duas diferentes marcas comerciais; os grupos com suple­men­tação da fibra ingeriram uma maior quantidade de ração quando comparado a seus controles. Também, em seus estudos, Gallaher CM e Azuma K, et al.(10,16) observaram maior ingestão alimentar nos grupos com suplementação de quitosana. Alguns estudos realizados observaram diminuição de leptina em animais que receberam suplementação com quitosana, indicando, desta forma, que houve diminuição na acumulação de lipídios, o que levou a um aumento na ingestão alimentar.(7,17-19)

Em relação à ingestão hídrica, os grupos C e CQ apresentaram maior ingestão, diferente dos grupos H e HQ, o que demonstra que a quitosana não atuou no aumento da ingestão hídrica, sendo característico de cada tipo de dieta. Da mesma forma, Geremias R e Azuma K, et al. relataram em seus estudos que a ingestão hídrica não se mostrou alterada durante o período experimental com quitosana e suas associações.(11,16)

Quanto à avaliação da concentração de Lactobacillus e Bifidobacterium verificou-se um aumento destas bactérias nos grupos que receberam a suplementação com quitosana, sendo que a quitosana, por ser uma fibra, apresenta as características de um prebiótico, não sendo hidrolisada nem absorvida na parte superior do trato gastrointestinal, sendo posteriormente fermentada por Lactobacilos e Bifidobactérias.(20) No entanto, percebe-se que o grupo HQ apresentou um aumento em relação à concentração destas bactérias, o que indica o potencial pre­biótico da quitosana que, ao ser administrada com a dieta hipercalórica, que contém chocolate em sua composição, apresentou um maior efeito na microbiota intestinal; de acordo com diversos estudos realizados, o chocolate atua como um prebiótico devido aos flavonoides que possui (derivados do cacau), levando a um aumento na concentração de Lactobacillus e Bifidobacterium.(21-23) Em relação à glicemia e ao teste de tolerância à glicose, os grupos com suplemen­tação de quitosana apresentaram uma tendência à diminuição destes parâmetros ao serem comparados com seus controles. Assim como encontrado em estudo de Chang HP et al.,(7) que analisaram o efeito da suplementação de quitosana em ratos diabéticos, embora não tenham obtido resultados significantes estatisticamente, houve uma tendência à diminuição de glicose e resistência à glicose após sete semanas de tratamento.

Ao se analisar a massa dos órgãos não foram encontradas diferenças significativas. No entanto, ao se analisarem as gorduras omental, perigonadal (epididimal) e retro­peritoneal (perirrenal), verificou-se uma diminuição da massa nos grupos que receberam suplementação de quitosana. Em seus estudos, Zhang J, et al. e Zhang H, et al.(12,24) observaram que ratos que receberam suplemen­tação de 5% (m/m) de quitosana apresentaram uma menor massa epididimal e perirrenal em relação aos grupos controle, demonstrando a ação da quitosana em reduzir a capacidade de armazenamento de gorduras.

 

 

 

 

 

CONCLUSÃO

 

A ação da quitosana em relação aos parâmetros glicêmicos foi positiva, a glicemia em jejum e o teste de tolerância à glicose demonstraram que a quitosana apresentou uma tendência à diminuição da glicemia.

O efeito da quitosana em relação aos parâmetros lipídicos apresentou-se eficaz, ao diminuir significativamente as concentrações de colesterol total e triglicerídeos.

Houve uma manutenção da massa corpórea dos animais que receberam a suplementação com quitosana, não apresentando, entretanto, redução significativa da massa corpórea. Faz-se necessária a realização de estudos com a administração de quitosana com dietas com restrição calórica e com adição de atividades físicas, para verificar seu efeito. A quitosana também nesta dose e neste período experimental não induziu ao aumento da saciedade, levando a um aumento da ingestão alimentar dos animais que receberam a suplementação.

Em relação à microbiota intestinal, a quitosana apresentou um efeito benéfico como prebiótico, aumentando as concentrações de bactérias probióticas. O grupo hiper­calórico com quitosana apresentou uma maior concentração destas bactérias, demonstrando a ação do cacau proveniente do chocolate presente na dieta hipercalórica, o qual, ao ser administrado com a quitosana, aumentou seu potencial prebiótico.

 

 

Abstract

Obesity has become frequent in developing countries, resulting in cardiovascular problems and other metabolic diseases. Among the ways to combat obesity is a healthy diet including mainly fibers. The objective was to verify if there would be a reduction in the body mass of rats supplemented with chitosan, decreasing the lipid and glycemic parameters and check their effect on the intestinal microflora. 16 female and 16 male mice from the Wistar lineage were used, which were divided into four groups (n = 4 males and n = 4 females), C, CQ, H, HQ. The treatment lasted 71 days. There was a reduction in body mass of groups treated with chitosan, but not statistically significant, however, food intake in the groups treated with chitosan was higher compared to their controls, the total cholesterol levels, triglycerides and glucose levels were reduced in mice supplemented with chitosan. The analysis of intestinal microbiota showed that the concentration of Lactobacillus and Bifidobacterium although not statistically significant, showed an increase in the concentration of these bacteria in mice supplemented with fiber. According to the results obtained in the study, chitosan acts in the control of body mass, especially by the action in metabolism of lipids, also acts as a prebiotic, aiding in increasing the concentration of probiotics, regulating the functions of the intestinal microbiota.

 

Keywords

Chitosan; Obesity; Intestinal microbiota; Lipid parameters

 

REFERÊNCIAS

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Camila Girotto

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