Assessment levels EC-SOD in volunteers using inhibition of epinephrine oxidation method

 

Fernanda Dapper Machado¹      

César Augusto Miorelli Campos²                                  

Tamiris Priscila Vingert³

Ana Luiza Ziulkoski⁴                                     

Magda Susana Perassolo⁴

 

 

 

¹Farmacêutica. Bacharel em Farmácia/Universidade Feevale – Novo Hamburgo, RS, Brasil.

²Bolsista de Iniciação Científica/Universidade Feevale – Novo Hamburgo, RS, Brasil.

³Bacharel em Farmácia/Universidade Feevale – Novo Hamburgo, RS, Brasil.

⁴Doutora/Universidade Feevale – Novo Hamburgo, RS, Brasil.

 

Instituição: Universidade Feevale – Novo Hamburgo, RS, Brasil.

Suporte Financeiro: Universidade Feevale e Fundação de Amparo à Pesquisa do Rio Grande do Sul (FAPERGS)

 

Artigo recebido em 17/07/2014

Artigo aprovado em 01/02/2016

 

Resumo

Objetivo: Avaliar os níveis de EC-SOD em voluntários através do método de inibição da auto-oxidação da adrenalina e correlacionar com as características clínicas, bem como comparar com os resultados obtidos com o método de redução do WST-1. Métodos: Foram avaliados os níveis de SOD de 63 voluntários através do método de inibição da auto-oxidação da adrenalina e de redução do WST-1. Resultados: Não houve correlação entre os níveis de SOD com a idade ou sexo dos voluntários, porém o nível de SOD foi maior nos voluntários que utilizavam uma quantidade maior de medicamentos por dia. Conclusão: Não houve correlação entre os dois métodos de quantificação de SOD.

 

Palavras-chave

Estresse oxidativo; Epinefrina; Superóxido dismutase

 

 

INTRODUÇÃO

 

O desequilíbrio entre espécies reativas de oxigênio (ROS) e os antioxidantes do organismo, em decorrência de fatores como alimentação inadequada e sedentarismo, pode levar a uma condição chamada de estresse oxidativo (EO). O EO é um dos fatores desencadeantes de condições patológicas, como doenças cardiovasculares, desordens neurológicas, doenças pulmonares e envelhecimento precoce.^(1,2)

A defesa enzimática do organismo para as ROS são as enzimas superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT), glutationa peroxidase (GPx), entre outras enzimas redutoras. A SOD é conhecida como a primeira linha de defesa, catalisando a dismutação do ânio superóxido em peróxido de hidrogênio, posteriormente transformado em água e oxigênio pela CAT, GPX ou outras.⁽¹⁾

Nos organismos eucariotos podemos encontrar duas formas intracelulares da SOD: a Cu-Zn-SOD e a Mn-SOD (encontrada principalmente na matriz mitocondrial), além da forma extracelular da enzima, a EC-SOD.⁽³⁾ A presença de SOD em diferentes compartimentos é importante devido à incapacidade do superóxido de permear membranas e, portanto, necessitar ser eliminado no mesmo compartimento em que foi formado.⁽⁴⁾

A superóxido dismutase extracelular (SOD; EC 1.15.1.1) (EC-SOD ou SOD-3) controla o nível de superó­xido no espaço extracelular, catalisando a dismutação do superóxido em peróxido de hidrogênio e oxigênio molecular. Além disso, a EC-SOD pode reagir com o peróxido de hidrogênio em uma reação peroxidase, a qual é conhecida por descontinuar sua atividade – podendo ser esse o mecanismo de controle da atividade enzimática. É expressa, principalmente, no pulmão e na musculatura vascular, mas também no coração, rins e placenta.^(4-7)

Existem diferentes métodos para a quantificação ou determinação da atividade da EC-SOD, entre eles o método desenvolvido por Misra e Fridovich, em 1972,⁽⁷⁾ baseado na capacidade da enzima em inibir a auto-oxidação da adrenalina. Apesar da existência de técnicas mais modernas, alguns trabalhos ainda utilizam o método baseado na auto-oxidação da adrenalina, como o desenvolvido por Dries, em 2011,⁽⁸⁾ e por Soares, em 2012,⁽⁹⁾ sobretudo em razão do baixo custo da análise.

Zhou e Prognon⁽¹⁰⁾ acreditam que haverá um crescimento do interesse no campo das determinações enzimáticas, sobretudo em relação às antioxidantes e antiestresse, o que aumenta a necessidade de conhecimento dos níveis de SOD e outras enzimas antioxidantes a população e confirmam que estudos nesta área são fundamentais. Para se ter um entendimento a respeito dos processos redutores é necessário contar com informações quantitativas da geração e remoção de superóxido e peróxido de hidrogênio em células e tecidos.⁽¹¹⁾

Alguns estudos sugerem que o estresse oxidativo ou a diminuição da proteção antioxidante estão relacionados com o avanço e a patologia de várias doenças, entre elas a esquizofrenia, a diabete melito tipo 2, onde, além da diminuição dos níveis de SOD, ocorre a glicação da enzima ligada aos eritrócitos, levando a uma baixa atividade enzi­mática.^(12,13)

A comparação entre os resultados de SOD obtidos por diferentes métodos é uma tarefa difícil, uma vez que pequenas alterações nas condições do ensaio levam a grandes diferenças no resultado.⁽¹⁰⁾ A escassez de estudos populacionais que apontem o nível de SOD no plasma humano dificulta a comparação de resultados obtidos em diferentes populações. Diante do exposto, evidencia-se a importância deste trabalho, que pretende avaliar os níveis de SOD em um grupo de voluntários pelo método de inibição da auto-oxidação da adrenalina e relacioná-lo com as características clínicas, além de comparar com o método de redução do WST-1.

 

MATERIAL E MÉTODOS

 

O estudo foi realizado com 63 participantes do projeto de pesquisa “Avaliação da relação entre qualidade de vida e estresse oxidativo em pacientes com diabete melito tipo 2”. Foram excluídos do estudo voluntários com doenças hepáticas ou renais. As análises laboratoriais, como glicose, glicohemoglobina, perfil lipídico e hemograma foram realizadas pelo Laboratório Escola de Biomedicina da Universidade Feevale. As características gerais e clínicas dos voluntários, como idade, sexo, tabagismo, patologias, consumo de medicamentos e alimentos antioxidantes, foram obtidas por meio de questionário próprio. As amostras de plasma para quantificação de EC-SOD foram armazenadas em temperatura de -80°C até o momento da análise.

Quantificação pelo método da auto-oxidação da adrenalina

Para a quantificação da SOD por meio do método baseado na inibição da auto-oxidação da adrenalina, as amostras foram diluídas em soro fisiológico, na proporção 1:10 (v/v), e quantidades crescentes do diluído (10, 15, 20, 25 e 30 ul) acrescidas de tampão glicina pH 10,2 a 32°C, solução de catalase e solução ácida de adrenalina; foram lidas em espectrofotômetro Varian, modelo Dig Varian Cary (50 NSEL03127475) no comprimento de onda de 480 nm durante 180 segundos, com intervalo de leitura de dez segundos, de acordo com a metodologia descrita por Misra e Fridovich.⁽⁷⁾  A curva resultante desta leitura foi comparada com a curva de oxidação da adrenalina obtida no mesmo dia da análise, sob as mesmas condições da amostra através de uma planilha do Microsoft Excel. O resultado final foi obtido por meio de cálculos baseados em regressões lineares e o valor resultante foi corrigido pelas proteínas totais obtendo-se um resultado expresso em g SOD/g proteína.

A dosagem de proteínas totais foi realizada por meio de kit comercial baseado no método do biureto.

 

Quantificação de SOD pelo método de redução do WST-1

A quantificação pelo método de redução do WST-1 foi realizada utilizando-se  o SOD Assay Kit-WST produzido pela Sigma Aldrich , que é baseado no método nitroazul tetrazólio (NBT). Trata-se de um método indireto, no qual a quantificação se dá por percentual de inibição de SOD por um método colorimétrico com leitura a 440 nm.

As amostras foram preparadas em placas com 96 poços; 20 ul de amostra foram adicionados no poço de amostra e no poço Branco 2. Água duplamente destilada foi adicionada no poço Branco 1 e Branco 3; 200 ul da solução de trabalho WST foram acrescentados em todos os poços. O tampão diluente foi adicionado nos poços Branco 2 e Branco 3 e a solução de trabalho da enzima foi adicionada nos poços contendo amostra e Branco 1. A placa foi incubada a 37°C por  vinte minutos para posterior leitura a 450 nm.⁽¹⁴⁾ O resultado foi obtido em atividade de SOD (% de inibição).

Os dados resultantes das análises e os dados clínicos dos pacientes foram armazenados em um banco de dados desenvolvido com o programa Microsoft Office Excel.

 

Análise estatística

As análises estatísticas foram realizadas por meio do programa SPSS, versão 20.0, utilizando nível de signifi­cância de 5%. Os resultados foram expressos em média e desvio padrão ou frequência. Para a análise estatística foi testada a normalidade das variáveis. As variáveis para­métricas tiveram a relação avaliada pela correlação de Pearson, e as não paramétricas, pela correlação de Spearman. A comparação das médias entre os grupos foi realizada por meio de ANOVA.

 

Aspectos éticos

Este trabalho está inserido no projeto de pesquisa “Avaliação da relação entre qualidade de vida e estresse oxidativo em pacientes com diabete melito tipo 2”, aprovado no Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Feevale sob o número de processo 4.03.01.11.1981. Os participantes assinaram o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido em duas vias, ficando uma com o pesquisador e outra com o voluntário. O estudo foi conduzido de acordo com a Resolução nº 466/2012 do Conselho Nacional de Saúde.⁽¹⁵⁾

 

RESULTADOS

 

Características gerais da amostra

As características gerais dos voluntários que compõem o perfil da amostra, como sexo, escolaridade e tabagismo, estão descritos na Tabela 1. A maioria dos voluntários foi mulheres (71,4%), com escolaridade de ensino funda­mental incompleto, com patologias diversas; entre as mais frequentes estão diabetes, hipertensão, hiperco­lesterolemia e depressão.

 

 

 

 

As informações laboratoriais, como perfil lipídico, glicemia, glicohemoglobina e hemograma dos voluntários encontram-se na Tabela 2.

 

Resultados SOD

Foram analisados os níveis de SOD conforme faixa etária. Observa-se, apesar da SOD cair com o passar da idade, que não foram encontradas diferenças estatísticas nestes valores entre as diferentes faixas etárias (p=0,405) (Tabela 3). Apesar dos valores de SOD entre homens e mulheres serem diferentes, esta diferença não foi significativa (p=0,817). Nos homens, a média de SOD foi de 3,57 (9,7) g SOD/g proteína e, nas mulheres, foi 3,89 (11,5) g SOD/g proteína.

 

Há correlação entre os níveis de SOD e a quantidade de medicamentos utilizada diariamente (r=0,293; p=0,021). E uma tendência à correlação entre o consumo semana de tomate com os níveis de SOD (r=0,239; p=0,061).

Na correlação de Pearson, comparando os dois métodos de detecção da SOD, o resultado não foi significativo (r=0,103; p=0,429).

 

DISCUSSÃO

 

Apesar da literatura apontar níveis aumentados de SOD em mulheres em relação aos níveis encontrados em homens, como o estudo de Bolzán, Bianchi e Bianchi⁽¹⁶⁾ e Malling et al.,⁽¹⁷⁾  esta diferença não foi observada no presente estudo. O número reduzido de homens em relação às mulheres entre os voluntários pode ter impedido a observação de alteração significativa nos níveis de SOD entre os dois grupos.

Existe relação entre o nível de estrogênio circulante e as condições antioxidantes, incluindo a produção enzimá­tica. O envelhecimento ovariano ocorre gradualmente, diminuindo os níveis de estrogênio e os níveis das enzimas antioxidantes por consequência.^(18,19) Portanto, a falta de diferença entre os níveis de SOD em homens e mulheres pode ser explicada pela idade da amostra, com mulheres já em menopausa e com diminuição dos níveis de estro­gênio.

A produção e atividade da SOD estão ligadas a características genéticas, como aponta estudo realizado com japoneses, que distingue a população em dois grupos: um com baixos níveis plasmáticos de SOD (aproximadamente 94%) e outro com níveis elevados (6%). Outro estudo semelhante, agora com suecos, demonstra que mutações na ligação da enzima com a heparina podem resultar em aumento dos níveis plasmáticos da EC-SOD, apesar das consequências dessa mutação ainda não estarem escla­recidas.⁽³⁾

Há uma tendência à diminuição da atividade da EC-SOD a partir dos 28 anos de idade, devido à inativação enzimática pelo peróxido de hidrogênio.⁽¹⁶⁾ A amostra foi composta por voluntários com idade média de 57,3^(7,10) anos, sendo todos acima de 35 anos. Portanto, a falta de correlação entre idade e SOD encontrada neste estudo pode ser explicada pela idade dos voluntários, uma vez que o período de mudanças nas concentrações da enzima já teria iniciado.

Os voluntários participantes deste estudo são, em sua maioria, portadores de alguma patologia; algumas delas têm relação direta com o estresse oxidativo ou a produção e atividade da SOD. Entre elas, a diabete melito tipo 2 e a hipercolesterolemia (como precursora da aterosclerose). Isso causa alterações nos níveis de EC-SOD detectados, podendo levar à falta de correlação com alguns parâmetros, como idade e sexo. ^(20,3)

Níveis elevados de EC-SOD estão relacionados com fatores de risco cardiovascular, síndrome coronariana aguda, hipertensão, diabete melito, lesões isquêmicas, doenças pulmonares, doenças neurológicas e inflamatórias.⁽²¹⁾

Entretanto, o comportamento da SOD frente à diabete melito tipo 2 não está completamente esclarecido, uma vez que tanto o aumento como a diminuição da atividade enzimática são relatados. Sabe-se que a patologia da doença, no que se refere à resistência à insulina e intolerância à glicose, responsáveis pelo desenvolvimento da diabete melito tipo 2, são mediadas pelo estresse oxidativo; bem como as complicações vasculares e ateroscleróticas associadas ao avanço da doença. Os níveis de EC-SOD também estão relacionados com o índice de massa corporal e índice de avaliação de resistência à insulina.^(20,22,23)

Em estudo realizado com pacientes diabéticos, Bandeira et al.⁽²⁰⁾ encontraram valores de SOD aumentados principalmente em pacientes com alta peroxidação lipídica. O aumento de SOD na presença do dano oxidativo pode ser explicado como uma resposta adaptativa do organismo contra o estresse oxidativo. Todavia, Ghattas e Abo-Emaltty⁽²²⁾ encontraram níveis de SOD diminuídos para pacientes com diabete melito tipo 2, o que pode ser conse­quência do nível elevado de peróxido de hidrogênio.

O tabagismo está associado a baixos níveis de SOD.⁽²⁴⁾ Por ser um grande formador de radicais livres, o álcool também está associado ao estresse oxidativo e alterações nos níveis das enzimas antioxidantes.⁽²⁵⁾

O estresse oxidativo implica na patogênese da aterosclerose e alguns antioxidantes têm demonstrado inibir o processo de aterogênese. Alguns estudos indicam o aumento na produção de superóxido em vasos ateros­cleróticos, podendo interferir no tônus vascular. Por outro lado, a expressão de EC-SOD é reduzida em pacientes com doença arterial coronariana, contribuindo com a disfunção endotelial nestes pacientes. Já em indivíduos hipercoles­terêmicos, a atividade da EC-SOD é aumentada, em uma possível tentativa do organismo em combater a disfunção endotelial. Essa superexpressão de SOD pode proteger contra a oxidação do LDL, grande contribuidor da formação da placa aterosclerótica.⁽³⁾

Alguns fatores relacionados a medicamentos, principalmente à sua toxicidade, incluem a formação de metabó­litos reativos, capazes de se ligarem covalentemente a proteínas e à geração do estresse oxidativo. Estes fatores podem ser aumentados pelo consumo concomitante de dois ou mais medicamentos.⁽²⁶⁾ A relação existente entre a quantidade diária de medicamentos e os níveis de SOD observada neste estudo pode ser explicada pela produção de superóxido durante a metabolização destas substâncias, tendo a produção da SOD como resposta adaptativa do organismo.

O tomate é um dos principais alimentos anti­oxi­dantes,⁽²⁷⁾  todavia não existem relatos na literatura de qualquer relação do consumo de tomate com os níveis plas­máticos da EC-SOD.

O método da adrenalina nos fornece resultados em g SOD/g proteína, enquanto que o método do WST-1 o faz por percentual de inibição da SOD, quantificando a atividade enzimática. Esta pode ter sido a principal causa da não correlação entre os métodos apresentada neste estudo.^(7,14)

Outras diferenças podem ter contribuído para a falta de correlação entre os resultados. Enquanto o método da adrenalina utiliza o adrenocromo para a quantificação de SOD, o método comercializado pela Sigma Aldrich (R) utiliza a formação do corante formazan, usando o WST-1 como componente cromóforo. Outro fator contribuinte é o fato do método de inibição da auto-oxidação da adrenalina necessitar acompanhamento constante de temperatura (32°C) e pH do tampão,^(2,10) e quaisquer intercorrências nessas me­didas podem prejudicar a execução da análise.^(7,10,14)

Outros estudos de comparação de métodos para a quantificação de SOD já foram realizados, como o de Zhou e Prognon,⁽¹⁰⁾ que testaram dois métodos enzimáticos para a determinação de SOD em matérias primas: o método referência NBT e o método WST-1. Seus resultados demonstraram que a qualidade dos resultados depende de pequenas variações nas condições experimentais. Os resultados extremamente semelhantes entre os métodos devem-se, principalmente, ao fato de ambos serem baseados no mesmo princípio.

 

CONCLUSÕES

 

Os níveis de EC-SOD sofrem influências genéticas e do meio, como consumo de medicamentos e alimentos antioxidantes. Para determinar a relação entre sexo, idade e SOD seriam necessários novos estudos, com maior número amostral. Não há correlação entre os métodos avaliados.

Desta forma, são necessários mais estudos populacionais que permitam traçar o perfil de SOD da população. Para isso, é interessante que se relacione a SOD com marcadores de peroxidação lipídica, como o MDA, e se obtenham as características genéticas para que, posteriormente, possa-se traçar o perfil de SOD para as diversas patologias a ela associadas.

Estudos no campo do estresse oxidativo e das defesas antioxidantes são extremamente necessários principalmente por causa do papel desempenhado pelo estresse oxidativo no avanço e patologia de inúmeras doenças. Neste estudo, não foi encontrada nenhuma correlação entre a atividade de SOD e fatores como idade ou sexo, porém é necessário que os níveis enzimáticos estejam bem esclarecidos.

 

 

Abstract

Objective: This study aim is evaluate EC-SOD levels by epinephrine auto oxidation method of volunteers and correlate it with clinical condition, as well as compare with WST-1 method results. Methods: It was assessment 63 volunteers SOD levels with inhibition of epinephrine oxidation method and the WST-1 reduction method. Results: There was no correlation between SOD levels and volunteer’s age or sex, but the SOD levels was higher on volunteers that was using more medicines per day. Conclusion: There was no correlation between the two measurement SOD methods.

 

Keywords

Oxidative stress; Epinephrine; Superoxide dismutase

 

 

REFERÊNCIAS

1. Acharya JD, Ghaskadbi SS. Islets and theyr antioxidant defense. Islets. 2010 Jul-Aug;2(4):225-35.
2. Rosanna DP, Salvatore C. Reactive oxygen species, inflammation, and lung diseases. Curr Pharm Des. 2012;18(26):3889-900.
3. Fattman CL, Schaefer LM, Oury TD. Extracellular superoxide dismutase in biology and medicine. Free Radic Biol Med. 2003 Aug 1;35(3):236-56.
4. Bafana A1, Dutt S, Kumar S, Ahuja PS. Superoxide dismutase: an industrial perspective. Crit Rev Biotechnol. 2011 Mar;31(1):65-76
5. Gottfredsen RH, Larsen UG, Enghild JJ, Petersen SV. Hydrogen peroxide induce modifications of human extracelular superoxide dismutase that results in enzyme inhibition. Redox Biol. 2013 Jan 11;1:24-31.
6. Nozik-Grayck E, Suliman HB, Piantadosi CA. Molecules in focus: Extracellular superoxide dismutase. Int J Biochem Cell Biol. 2005 Dec;37(12):2466-71.
7. Misra HP, Fridovich I. The role of superoxide anion in the autoxidation of ephinephrine and a simple assay for superoxide dismutase. J Biol Chem. 1972 May 25;247(10):3170-5.
8. Dries SS. Estresse oxidativo em pacientes com diabetes mellitus tipo 2 em tratamento com metformina (TCC). Curso de Ciências Farmacêuticas, Instituto de Ciências da Saúde, Universidade Feevale, Novo Hamburgo, 2011. Disponível em: http://ebooks.pucrs.br/edipucrs/anais/seminarioic/20112/4/3/2/2.pdf
9. Soares BS. Influência do tratamento farmacológica com metformina e glibenclamida sobre o estresse oxidativo em pacientes com diabetes mellitus tipo 2. (TCC) Faculdade de Farmácia, Instituto de Ciências da Saúde, Universidade Feevale, Novo Hamburgo, 2012.
10. Zhou JY. Prognon P. Raw material enzymatic activity determination: a specific case for validation and comparison of analytical methods–the example of superoxide dismutase (SOD). J Pharm Biomed Anal. 2006 Mar 18;40(5):1143-8.
11. Wagner BA, Witmer JR, van ‘t Erve TJ, Buettner GR. An assay for the rate of removal of extracelular hydrogen peroxide by cells. Redox Biol. 2013;1(1):210-7.
12. Bhatia S, Shukla R, Venkata Madhu S, Kaur Gambhir J, Madhava Prabhu K. Antioxidant status, lipid peroxidation and nitric oxide and products in patients of type 2 diabetes mellitus with nephropathy. Clin Biochem. 2003 Oct;36(7):557-62.
13. Wu JQ, Kosten TR, Zhang XY. Free radicals, antioxidant defense systems, and schizophrenia. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry. 2013 Oct 1;46:200-6.
14. Sigma Aldrich. 19160 SOD determination kit. Suíça, outubro, 2004.
15. Brasil, Conselho Nacional de Saúde. Resolução nº 466 de 12 de dezembro de 2012. Aprova as diretrizes e normas de pesquisas envolvendo seres humanos. 1996.
16. Bolzán AD, Bianchi MS, Bianchi NO. Superoxide dismutase, catalase and glutathione peroxidase activities in human blood: influence of sex, age and cigarette smoking. Clin Biochem. 1997 Aug;30(6):449-54.
17. Malling TH, Sigsgaard T, Andersen HR, Deguchi Y, Brandslund I, Skadhauge L, et al. Differences in association between markers of antioxidative defense and asthma are sex specific. Gend Med. 2010 Apr;7(2):115-24
18. Bellanti F, Matteo M, Rollo T, De Rosario F, Greco P, Vendemiale G, et al. Sex hormones modulate circulating antioxidant enzymes: impact of estrogen therapy. Redox Biol. 2013 Jun 19;1:340-6.
19. Peji? SA, Kasapovi? JD, Todorovi? AU, Stojiljkovi? VR, Gavrilovi? LV, Popovi? NM, et al. Antioxidant enzymes in women with endometrial polyps: relation with sex hormones. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol. 2013 Sep;170(1):241-6.
20. Bandeira Sde M, Guedes Gda S, da Fonseca LJ, Pires AS, Gelain DP, Moreira JC, et al. Caracterization of blood oxidative stress in type 2 diabetes mellitus patients: increase in lipid peroxidation and SOD activity. Oxid Med Cell Longev. 2012;2012:819310.
21. Grammer TB, Renner W, Hoffmann MM, Kleber M, Winkelhofer-Roob BM, et al. SOD 2 R231G polymorphism associated with coronary artery disease and myocardial infarction. The Ludwigshafen Risk and Cardiovascular Health (LURIC) study. Free Radic Res. 2009 Jul;43(7):677-84.
22. Ghattas MH, Abo-Elmatty DM. Association of polymorphic markers of the catalase and superoxide dismutase genes with type 2 diabetes mellitus. DNA Cell Biol. 2012 Nov;31(11):1598-603.
23. Kamiya T1, Hara H, Inagaki N, Adachi T. The effect of hypoxia mimetic cobalto chloride on the expression. of EC-SOD in 3T3-L1 adipocytes. Redox Rep. 2010;15(3):131-7.
24. Naga Sirisha CV, Manohar RM. Study of antioxidant enzymes superoxide dismutase and glutathione peroxidase level in tobacco chewers and smoker: a pilot study. J Cancer Res Ther. 2013 Apr-Jun;9(2):210-4.
25. Yao P, Li K, Jin Y, Song F, Zhou S, Sun X, Nüssler A, Liu L. Oxidative damage ofter chronic ethano intake in rat tissues: prophylaxis of Ginkgo biloba extract. Food Chemistry. 2006;99:305-14.
26. Ramm S, Mally A. Role of drug-independent stress factors in liver injury associated with diclofenac intake. Toxicology. 2013 Oct 4;312:83-96 . Erratum in Toxicology. 2014 Feb 28;316:71-4.
27. Bianchi MLP, Antunes LMG. Radicais livres e os principais antioxidantes da dieta. Rev. Nutr.,maio/ago. 1999;12(2):123-30.

 

 

 

Correspondência

Fernanda Dapper Machado

ERS-239, 2755

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