Evaluation of the formation of bacterial biofilm in different orthopedic metallic alloys

 

Yasmin de Rezende Beiriz¹, Amanda Grippa Piffer¹, Rodrigo Moraes², Rodrigo Pratte Santos³, Bil Randerson Bassetti⁴, Igor de Barcellos Zanon⁵, Igor Machado Cardoso⁵, Charbel Jacob Junior⁶, Igor Pecinalli⁷

 

¹  Acadêmica de Medicina. Escola Superior de Ciências da Santa Casa de Misericórdia de Vitória (EMESCAM). Vitória, ES, Brasil.

²  Mestre em Microbiologia UFMG. Escola Superior de Ciências da Santa Casa de Misericórdia de Vitória (EMESCAM). Vitória, ES, Brasil.

³  Doutor em Engenharia Ambiental. Faculdade PIO XII e Universidade Federal do Espírito Santo. Vitória, ES, Brasil.

⁴  Infectologista. Hospital Santa Rita de Cássia, Vitória, ES, Brasil.

⁵  Ortopedista. Hospital Santa Casa de Misericórdia de Vitória. Vitória, ES, Brasil.

⁶  Doutor em Medicina/Saúde da Criança. Professor do departamento de Ortopedia da Escola Superior de Ciências da Santa Casa de Misericórdia de Vitória (EMESCAM). Vitória, ES, Brasil.

⁷  Acadêmico de Medicina. Escola Superior de Ciências da Santa Casa de Misericórdia de Vitória (EMESCAM). Vitória, ES, Brasil.

 

Recebido em 10/04/2021

Aprovado em 10/02/2022

DOI: 10.21877/2448-3877.202202135

 

INTRODUÇÃO

 

As doenças do sistema osteomuscular foram a causa de morbidade de mais de 200.000 pessoas em território brasileiro no ano de 2017, sendo que em muitas dessas doenças há demanda de cirurgia.^(1,2) Os biomateriais ortopédicos utilizados no tratamento dessas patologias podem ser introduzidos no corpo humano substituindo ou reparando diferentes tecidos⁽¹⁾ e até orientando a reparação óssea, quando necessário.^(2,3)

A infecção causada por bactérias é uma das principais limitações para a permanência dos biomateriais ortopédicos, como hastes no organismo.^(4,5) Próteses utilizadas para correção em cirurgia de coluna vertebral estão relacionadas com uma taxa de infecção de 2% a 20%.⁽²⁾ A adesão bacteriana aos biomateriais é um processo de alta complexidade que demanda preocupação, dada a sua influência sobre a morbidade e mortalidade dos pacientes.⁽⁶⁾ A adesão a superfícies inertes pelas bactérias é um mecanismo de sobrevivência, contudo também é um importante fator de virulência.⁽⁷⁾ O risco de infecção também pode variar de acordo com o tipo de prótese, devido a uma maior suscetibilidade ao desenvolvimento de biofilme em cada um dos tipos.⁽²⁾

De maneira geral, os implantes ortopédicos de coluna vertebral são compostos de polímeros ou de ligas metálicas, sendo que neste último é necessária maior concentração bacteriana para o desenvolvimento de infecções.⁽⁸⁾ Entre os metais, as ligas de titânio são menos propensas às infecções quando comparadas às de cromo-cobalto, por apresentar resistência à corrosão e ser mais inerte quando implantado em tecidos humanos.^(9,10) Em estudos comparando a diferença de propensão à formação de biofilme em ligas de cromo-cobalto e titânio, notou-se que os primeiros apresentaram maior tendência a essa formação.⁽¹¹⁾ Dentre as inúmeras bactérias envolvidas nos estudos de biofilme, destacam-se Pseudomonas aeruginosa e Staphylococcus aureus.⁽¹²⁾ Estudos realizados comparando a liga de titânio em relação ao cromo-cobalto mostraram que a liga de titânio apresenta menor nível de aderência bacteriana.⁽¹³⁾ A espécie P. aeruginosa é um bacilo Gram-negativo aeróbico pertencente à família bacteriana Pseudomonadaceae, com metabolismo oxidativo e temperatura ótima de crescimento entre 37°C e 42°C. Suas infecções predominam em pacientes críticos e 13 imunocomprometidos.^(6,14) Estudos em vários países mostram a presença de Pseudomonas aeruginosa multirresistentes a antimicrobianos causando infecções hospitalares.^(15-19) Desse modo, esse estudo objetiva identificar o desenvolvimento da bactéria Pseudomonas aeruginosa, forte produtora de biofilmes nos biomateriais titânio e cromo-cobalto.

 

MATERIAL E MÉTODOS

 

O estudo foi realizado no laboratório de Microbiologia da Escola Superior de Ciências da Santa Casa de Misericórdia de Vitória (EMESCAM) e o biofilme formado no meio de cultura das amostras de hastes de titânio e de cromo-cobalto foi avaliado de acordo com a quantidade de Pseudomonas aeruginosa desenvolvida nas amostras. O estudo se iniciou com o repique da bactéria Pseudomonas aeruginosa, forte produtora de biofilme, centrifugação da cultura restante a 3500 rpm por 10 minutos e lavagem da biomassa com tampão de fosfato (PBS – bactérias solubilizadoras de fosfato) pH 7,2. A biomassa foi, então, suspensa em 3mL de PBS e a turvação da suspensão foi monitorada por densidade óptica (DO) em espectrofotômetro para avaliar a absorbância de cada uma das amostras. A amostra com maior absorbância (0,313), ou seja, com maior concentração de bactérias, foi utilizada para a pesquisa.⁽¹⁵⁾ Fez-se, então, a preparação dos inóculos de bactéria, que foram transferidos individualmente para tubos Falcon de 15mL esterilizados, contendo 5mL de caldo Mueller-Hinton. Os corpos de prova de cada biomaterial foram esterilizados e introduzidos nestes tubos, permanecendo incubados a 37ºC, sob agitação, em estufa por 17 horas e por 168 horas (uma semana), a fim de viabilizar a formação de biofilme nos materiais.⁽¹⁵⁾ Após estes períodos de incubação, as hastes foram retiradas dos tubos e lavadas separadamente com salina fisiológica estéril. Os biofilmes formados nesses materiais foram fixados com etanol, secos em ar ambiente e corados com cristal violeta por 5 minutos. O excesso de corante não ligado ao biofilme foi removido lavando-se as amostras com água destilada.⁽¹⁵⁾

Após essa etapa, os corpos de prova foram secos ao ar, colocados em contato com salina tamponada com fosfato pH 7,2, em seguida foram submetidos ao vórtex por 3 minutos. Após esse processo, foi feita sonicação por 5 minutos a 120 W para separar o biofilme formado do biomaterial.⁽¹¹⁾ Após a sonicação, as amostras foram novamente vorticadas por 3 minutos. As suspensões restantes tiveram seus valores de absorbância medidos a 570 nm por espectofotômetro Espectronic 20 – Baush Lomb para determinar a quantidade de biofilme formado em cada biomaterial.⁽¹⁵⁾ Esse ensaio⁽¹⁵⁾ foi realizado em triplicata, utilizando-se três amostras de cada material para a avaliação por 17 horas e três amostras de cada material para a avaliação por 168 horas, isto é, uma semana.

Foi utilizada a estatística descritiva para apresentação dos resultados da avaliação da formação de biofilme bacteriano em diferentes ligas metálicas (titânio e cromocobalto). A normalidade dos dados obtidos foi testada a partir do teste Shapiro-Wilk, a fim de verificar como se apresentava tal distribuição. Para a comparação entre os grupos com distribuição normal foi utilizado o teste paramétrico ANOVA, seguido do teste de Tukey. Os dados com distribuição não normal foram comparados com a utilização do teste Kruskal-Wallis, seguido do teste de Dunn. Para todas as análises foi considerado o nível de significância de 5%. As análises estatísticas foram realizadas com o auxílio do programa graphpadPrism 6.01.

 

RESULTADOS

 

Dentre os biomateriais testados no presente estudo, observou-se que a formação de biofilme nas ligas de titânio foi significativamente maior (p<0,05) do que o observado nas ligas de cromo-cobalto tanto em 17 horas quanto em 1 semana (Figura 1).

Além disso, foi observado que o crescimento bacteriano em cromo-cobalto obteve diferença significativa quando comparado os tempos 17 horas e 1 semana de incubação (p=0,0346). Para os resultados do crescimento bacteriano no biomaterial titânio, não foi observada diferença significativa (p=0,95) (Figura 2).

Figura 1

Comparação do crescimento bacteriano nos biomateriais cromo-cobalto e titânio em 17h e 1 semana. Letras diferentes no gráfico indicam diferença significativa pelo teste-T (p<0,05).

Figura 2

Comparação temporal (17h e 1 semana) do crescimento bacteriano nos biomateriais cromo-cobalto e titânio.

 

 

DISCUSSÃO

 

Dados na literatura não apontam um consenso sobre como as características físicas de um biomaterial influenciam a formação precoce do biofilme. É possível que características físico-químicas adicionais, como íons metálicos liberados e estrutura química, possam ter alguma influência que iniba ou retarde o desenvolvimento do biofilme.⁽¹⁵⁾ Outros estudos advogam que a composição química e a superfície são características dos biomateriais que mais influenciam na sua capacidade de interagir com microrganismos,^(15,20) de forma que a formação inicial de biofilme é um processo multifatorial que dificilmente pode ser explicado por uma única característica de superfície.⁽¹⁵⁾ Poucos estudos comparam a formação de biofilme bacteriano entre titânio e cromo-cobalto e, quando comparados, apresentam resultados contraditórios. Há indícios de que as ligas de titânio são menos propensas às infecções quando comparadas às de aço e de cromo-cobalto,^(21-24) o que ocorre devido a uma melhor biointegração do titânio, mais inerte quando implantada em tecidos humanos.⁽²²⁾ Os implantes de liga de titânio permitem que células hospedeiras se desenvolvam em um revestimento de tecido fibroso, dificultando a aderência bacteriana na superfície do implante.⁽²⁵⁾ Além disso, o titânio pode manter as bactérias dispersas na superfície do implante, tornando-as mais suscetíveis aos antibióticos.⁽²⁶⁾ As ligas de cromo-cobalto, por apresentarem reduzida integração com células do hospedeiro, dispõem de mais energia livre em sua superfície, o que permite mais colonização bacteriana.^(7,22)

Estudos também concluíram que implantes de cromo-cobalto tiveram maior propensão para formação de biofilme em comparação com implantes de liga de titânio em 48 e 96 horas de incubação.⁽²⁷⁾ Contudo, observaram que após 6 horas a liga de cromo-cobalto-molibdênio (Cr-Co-Mo) formou menos biofilme que a liga de titânio, de modo que propriedades da superfície, como a hidrofobicidade ou a baixa energia livre superficial do Co-Cr-Mo, podem ter alguma influência na inibição ou no ato de retardar a expansão bidimensional do biofilme em superfícies com um grau semelhante de suavidade.⁽¹⁵⁾ Um estudo comparando o titânio com outros materiais avaliou o titânio e o aço inoxidável, concluindo que o primeiro obteve uma taxa de infecção mais baixa que o aço inoxidável, corroborando o fato de que o material do implante impacta diretamente na taxa de infecção.⁽²⁸⁾

Apesar do presente trabalho mostrar que o titânio forma mais biofilme que o cromo-cobalto, dados na literatura já indicam que o aço inoxidável permite mais formação de biofilme que o titânio.⁽²⁸⁾ Além disso, foi observado por meio do presente estudo que manter a bactéria em contato com o cromo-cobalto por uma semana favoreceu a formação de biofilme, sugerindo que quanto maior o tempo da prótese, maior é a chance de formação de biofilme. É importante salientar que estudos afirmam que as características inerentes do substrato, como rugosidade da superfície e a tendência hidrofóbica relativa da instrumentação, são pré-requisitos importantes para a formação de biofilmes.⁽²⁹⁾ Essas características também devem ser levadas em consideração por parte do ortopedista no momento da escolha do material.

 

CONCLUSÃO

 

Os resultados do desenvolvimento da bactéria Pseudomonas aeruginosa demonstraram maior formação de biofilme no biomaterial titânio em comparação com os dados observados do crescimento bacteriano em cromo-cobalto. Também foi observado que o cromo-cobalto apresentou maior crescimento bacteriano quando avaliado após uma semana de incubação.

 

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